多样本联合分型#
多个样本一起分析时，推荐 GATK 的 gVCF 流程：每个样本单独生成 gVCF，把所有样本的 gVCF 合并成一个多样本 gVCF，再对合并结果做联合分型，得到群体 VCF。新增样本时只需为新样本生成 gVCF，再重新合并和分型。
--emit-mode gvcf每个样本一次
可同时联合分型：
--genotype-out概述#
| 步骤 | 命令 | 对应的 GATK 工具 | 输出一致性 |
|---|---|---|---|
| 单样本 gVCF | haplotyper --emit-mode gvcf |
HaplotypeCaller -ERC GVCF |
逐条记录相同 |
| 合并 gVCF | combinegvcfs |
CombineGVCFs 4.6.2.0 | 逐条记录相同（表头除 ##GATKCommandLine 外也相同） |
| 联合分型 | gvcftyper，或 combinegvcfs --genotype-out |
GenotypeGVCFs 4.6.2.0 | 逐条记录相同 |
分步说明#
1. 为每个样本生成 gVCF#
baizegen-gpu haplotyper --device gpu -R REFERENCE -I SAMPLE.bam -t NUMBER_THREADS \
--emit-mode gvcf -O SAMPLE.g.vcf.gz
--emit-mode gvcf与 GATK 的-ERC GVCF等价（也接受-ERC GVCF写法）。逐碱基输出用--emit-mode bp_resolution。- 多倍体样本加
--ploidy N。不同倍性的样本可以一起合并和分型。
2. 合并 gVCF 并联合分型#
ls gvcf/*.g.vcf.gz > GVCF_LIST # 每行一个 gVCF 路径
baizegen-gpu combinegvcfs --device gpu -R REFERENCE --variant-list GVCF_LIST -t NUMBER_THREADS \
-O COHORT.g.vcf.gz --genotype-out COHORT.vcf.gz
需要的输入：
- REFERENCE：参考基因组 FASTA（需要
.fai）。 - GVCF_LIST：gVCF 路径列表文件，每行一个；也可以用多个
-V SAMPLE.g.vcf.gz逐个给出。 - COHORT.g.vcf.gz：合并后的多样本 gVCF，与 GATK CombineGVCFs 的输出逐条相同。
- COHORT.vcf.gz（可选）：
--genotype-out在合并的同时做联合分型，输出与之后对合并结果单独运行gvcftyper逐字节相同。不需要 VCF 时去掉这个参数。
输入顺序会影响输出
与 GATK 一样，-V / --variant-list 中 gVCF 的顺序会影响输出中等位基因的排列顺序。要与其他结果对比时，请使用相同的输入顺序。
说明：
-t N（N ≥ 2）且输出为.gz时，按基因组区段并行处理，输出与单线程相同。--device gpu（仅 GPU 版）在 GPU 上完成合并、联合分型和压缩，结果与 CPU 相同；--gpus N|all选择显卡。- gVCF 表头中染色体的顺序与参考基因组不同、或表头多出参考基因组没有的染色体，都可以直接运行（与 GATK 相同）；同名染色体长度不一致时才需要加
--disable-sequence-dictionary-validation。 - 只处理部分区域时用
-L/-XL（需要输入 gVCF 有索引）。 - 主机内存紧张时任务会等待而不是被系统终止。大队列（数百个样本）请预留充足内存。
- 不要求与 GATK 逐字节相同时，可加
--merge-ties-by-input提速，见加速选项。
3. 对已合并的 gVCF 联合分型#
已有合并好的 gVCF（或者只有一个单样本 gVCF）时，用 gvcftyper 分型：
baizegen gvcftyper -r REFERENCE -v COHORT.g.vcf.gz -t NUMBER_THREADS [-d DBSNP] -O COHORT.vcf.gz
- -r REFERENCE：参考基因组，需要同时有
.fai和.dict。注意这里是小写-r。 - -v：一个 gVCF（单样本或多样本）。与 GATK GenotypeGVCFs 一样，只接受一个输入；多个样本请先用
combinegvcfs合并。 - -d DBSNP（可选）：dbSNP VCF，用于填写 ID 列。
-t N（N ≥ 2）时按区段并行，输出与单线程相同；需要输入有 tabix 索引，没有时会自动创建。- 输出中样本按名称排序，与 GenotypeGVCFs 相同。
GATK 3 / 4.0 产生的旧 gVCF
旧版本 GATK 的 gVCF 使用 RAW_MQ 注释。GenotypeGVCFs 遇到这种记录会报错退出，gvcftyper 也一样（退出码 2）。加 --allow-old-rms-mapping-quality-annotation-data 按 GATK 的旧规则计算 MQ。
加速选项：--merge-ties-by-input#
合并时经常有多个样本在同一位置都有记录，需要决定它们的合并先后。GATK 按其内部排序结构当时的状态决定先后：这个顺序没有生物学含义，却取决于从基因组开头到该位置的全部历史，只能逐条依次计算。默认情况下 combinegvcfs 完全复现这个顺序，因此这一步只能用一个 CPU 核；在单核较慢的机器上它决定整个任务的耗时，增加显卡也不会更快。
加 --merge-ties-by-input 后，同一位置的记录改按输入列表（-V / --variant-list）中的顺序合并。这个规则不依赖前面的历史，可以分给多个 CPU 核和多张显卡同时计算。代价是输出不再与 GATK 逐字节相同。
结果有何不同#
绝大多数差异只是多等位位点上 ALT 的排列顺序：合并后的 ALT 按记录合并的先后排列。等位基因是同一组，每个样本的基因型也相同，只是编号随顺序变化；AC、AF、MLEAC、PL 等按等位基因排列的数值随之重排，数值本身不变。例如某个位置上样本 1 是 A→T、样本 2 是 A→G：
样本 2：A → G
先后由之前的全部历史决定
样本 2：A → G
--merge-ties-by-input先样本 1，后样本 2按输入列表的顺序
两种写法中样本 1 都是 A/T，只是 T 的编号从 2 变成了 1。
极少数位点（约每 4 万个位点 1 个）的数值有变化：
- QUAL 的最后一位数字（似然值相加的先后不同带来的舍入差别）；
- 候选等位基因超过 6 个的位点，保留哪 6 个可能不同（GenotypeGVCFs 默认每个位点最多保留 6 个）；
- 少数缺失变异的写法，以及被它覆盖的位点上的
*。
100 个猪样本（20 Mb 区段）实测的比例：
| 仅 ALT 顺序不同 | 数值有变化 | |
|---|---|---|
| 合并后的 gVCF 记录 | 约 0.09% | 0 |
| 联合分型后的 VCF 位点 | 约 2.4% | 约 0.0024% |
按此比例，全基因组 VCF 的约 5,600 万个位点中，约 130 万个仅 ALT 顺序不同，约 1,300 个数值有变化；全基因组实测的变异位点总数相差 2 个。
两种结果都是正确的：区别只在于同一位置的记录谁先谁后，没有哪一种更准确。
结果可重复
输入文件和输入顺序相同时，无论在哪台机器上、用几张显卡，--merge-ties-by-input 的输出都逐字节相同。与默认方式一样，改变输入顺序会改变输出，请固定输入列表的顺序。
速度#
gVCF 共 339 GB，输入在本地 NVMe；2 × Xeon Gold 6226R（共 32 核 64 线程），-t 64；一次输出 gVCF 和 VCF。倍数相对同一显卡数的默认方式。
- 默认方式的耗时取决于 CPU 单核速度，增加显卡不会更快。
- 加
--merge-ties-by-input后主要工作量转到显卡上，第二张显卡才能发挥作用。 - 峰值内存约 44–46 GB（默认方式约 28–31 GB）。
如何选择#
- 需要与 GATK 结果逐字节比对（验收、对标测试）：使用默认方式。
- 只关心分析结果、希望更快：加
--merge-ties-by-input。在 CPU 单核较慢、有多张显卡的机器上效果最明显；单核很快、只有一张显卡时可能没有提升。
参考耗时#
- 100 个猪样本全基因组（gVCF 共 339 GB，输入在本地 NVMe，1 × RTX 5090 32 GB + Threadripper 3960X）：
combinegvcfs --device gpu --genotype-out一次输出 gVCF 和 VCF 共 11 分 40 秒，峰值内存 25.8 GB。 - 同一批 100 个猪样本在 2 × RTX 4090 24 GB + 2 × Xeon Gold 6226R 上：默认 14 分 40 秒，加
--merge-ties-by-input6 分 58 秒（见加速选项）。 - 857 个玉米样本（gVCF 共 4.75 TB，输入输出都在 NAS 上）：全基因组 gVCF + VCF 约 4–5 小时，峰值内存约 150 GB。